Зразок роботи
ВСТУП
Структура фармацевтичного біотехнологічного ринку України відрізняється від структури світового виробництва. Нині в Україні розвиток сучасних фармацевтичних біотехнологій проходить стадію становлення, хоча традиційні біотехнології використовуються у виробництві лікарських препаратів понад 20 років [14].
Ергостерин – вихідний продукт для виробництва жиророзчинного вітаміну D. Група вітамінів D об’єднує споріднені сполуки, найважливішими з яких є вітамін D2 і D3, яким притаманні антирахітичні властивості.
За нестачі вітамінів групи D, у дітей переважно перших трьох років життя з'являються ознаки рахіту. В дорослих (особливо у вагітних жінок), які мало перебувають на сонці, не вживають достатньо повноцінної їжі, кісткова тканина втрачає кальцій і кістки розм'якшуються. В цих випадках таке явище називають остеопорозом. Недостатність вітамінів групи D може розвиватись і у дітей старших трьох років, особливо в періоди інтенсивного росту, якщо їх білкове харчування є недостатнім, а також має місце різка зміна кліматичних умов. Крім того, до розвитку D-вітамінної недостатності ведуть хронічна ниркова недостатність, хвороби печінки, тривалий прийом проти судомних препаратів, синдром мальабсорбції (порушеного всмоктування в кишечнику) різного генезу [2].
Тому важливе значення має пошук нових безпечних джерел надходження вітамінів у організм. У випадку із вітаміном D2, використання препаратів мікробіологічного синтезу має значні переваги перед синтетичними аналогами, і з точки зору сприйнятливості організмом, і з точки зору економії енергоресурсів, затрачених на процес синтезу. Використання провітаміну D2 (ергостерину) також є більш доцільним, аніж використання готового препарату D2, оскільки організм людини здатний самостійно перетворювати провітамін у вітамінну форму, за умови достатньої кількості субстрату та сонячного світла [7].
Клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae широко використовуються як продуценти в сучасних біотехнологіях. На сьогодні перспективним є пошук нових, більш ефективних технологічних схем виділення та очистки кінцевого продукту (ергостерину) з доступного біопродуценту (Saccharomyces cerevisiae).
Останні кілька років увага багатьох дослідників прикута
до підвищення ергостериногенезу у дріжджів S. cerevisiae.
Зусилля вчених спрямовані на реалізацію таких двох завдань:
– підвищення вмісту ергостерину у дріжджових клітинах
оптимізацією умов культивування і створенням генно-інженерних штамів;
– підвищення концентрації біомаси дріжджів, що також дасть змогу збільшити кількість одержаного ергостерину [3].
Новизною даного проекту є використання модифікованого штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae D7. Оптимізація складу поживного середовища для даного штаму з використанням модифікованого методу Розенброка на наступних компонентах: глюкоза, дріжджовий екстракт (Difco), сульфат амонію, дигідрофосфат калію, сульфат магнію та хлорид кальцію, а також рівень розчиненого кисню, що повинен бути вище критичного рівня (18%) дають змогу отримати концентрацію ергостерину 4,8 г/л в культуральній рідині [20]. Даний штам синтезує більший вміст ергостерину порівняно з іншими штамами, наприклад S. cerevisiae YEH56(pHXA42) – 1,7 г/л, S. cerevisiaeY-E-1 – 2 г/л.
Поживне середовище з глюкозою та дріжджовим екстрактом (Difco) для штаму S. cerevisiae D7 є найоптимальнішим для синтезу ергостерину за умови інтенсивної аерації, надлишку вуглеводів та обмеження азоту (C:N =70:1) [20].
ХАРАКТЕРИСТИКА ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ
Основні теоретичні відомості про ергостерин
Природні джерела вітаміну D досить обмежені. Відомо, що вітамін D зустрічається лише в деяких тваринних та рибних продуктах (риб’ячий жир, печінка риб, вершкове масло, молоко, ікра), а також в яєчному жовтку. Рослини, як правило, не містять вітамінів групи D, проте серед стеринів рослинних жирів виявлено провітамін D – ергостерин.
Багаті на вітамін D лише печінкові жири риб. Деякі з них, наприклад печінковий жир тунця, містить в 1 г від 40 до 60 од. вітаміну D2.
В молоці, вершковому маслі і яйцях вміст вітаміну D2 обмежений. Наприклад, в 100 г молока міститься лише 1 од. D2 , у вершковому маслі – 40 – 320 од [2].
Незначний вміст вітаміну D2 в природніх продуктах змушує шукати багаті природні джерела провітаміну D2 – ергостерину.
В 30-х роках ХХ ст. рядом дослідників було виявлено, що хлібопекарські дріжджі являються багатим джерелом ергостерину. Пізніше було встановлено, що деякі мікроорганізми можуть слугувати джерелом вітаміну D [7].
Ергостерин – ергоста-5,7,22-трієн-3β-ол – вихідний продукт виробництва жиророзчинного вітаміну D2 і кормових препаратів, збагачених вітаміном D2. В групу вітамінів D об’єднують споріднені сполуки, найважливішими з яких є вітаміни D2 і D3, що мають антирахітичну дію. Вітамін D2 (ергокальциферол) утворюється під час опромінення ультрафіолетовим випромінюванням ергостерину, вітамін D3 (холекальциферол) утворюється із 7-дегідрохолестерину. В організмі людини і тварин ці сполуки регулюють засвоєння кальцію та фосфору із їжі і відкладання їх в кістковій тканині [7].
Продуценти ергостерину
Джерелом ергостерину є фітопланктон, бурі і зелені водорості, але особливо багаті на ергостерин дріжджі та плісняві гриби, які слугують сировиною для його промислового виробництва.
Культурні раси дріжджів завжди містять більше стеринів, ніж дикі. Найбільшу кількість стеринів містять пекарські та пивні дріжджі.
Бактерії, як правило, синтезують дуже малі кількості стеринів. Зазвичай, вміст стеринів в їхніх клітинах складає 0,001 – 0,1 мг/г сухої біомаси. Стерини виявлено в Lactobacillus arabinosus, L. pentosus, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum, Micromonospora sp., Streptomyces griseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum. Але відомо два представника бактерій: Halobacterium cutirubrum і Methylococcus capsulatus, що синтезують високі кількості сквалену (1,0 і 5,5 мг відповідно на грам сухих клітин). Сквален і його чотири гідроформи виділені із метанутворюючої бактерії Methanobacillus kuzneceovii [5].
Джерелом отримання ергостерину також може слугувати міцелій грибів, що залишається як відхід антибіотичної промисловості і виробництва лимонної кислоти.
Найбільшу кількість стеринів містять хлібопекарські та пивні дріжджі. Найвищі кількості стеринів (понад 10 % у біомасі) синтезують штами Saccharomyces carlsbergensis [3].
У дріжджів роду Saccharomyces із біомаси синтезується ергостерину 12,3-31,5% від кількості стеринів фракції ліпідів. А у дріжджів родів Candida та Rhodotorula синтезується з біомаси 8,5-11% стеринів [5].
Крім дріжджів, продуцентами ерогостерину можуть бути міцеліальні гриби - аспергіли і пеніцили, у біомасі яких міститься 1,2-2,2 % ергостерину. Показано можливість використання як продуценту ергостерину мукоревого гриба В. trispora 811 і 812, який за оптимальних умов культивування (підвищення концентрації глюкози у середовищі, добавлення у середовище культивування попередника ергостерину – сквалену) накопичує у біомасі до 2,2 % ергостерину [3].
Магістр